Enero 2023

• Screening territorial sobre presencia de organosforados realizando un setup inicial con CGC/MS portátil (cromatógrafo masa para gases portátil, muy caro y hay muy pocos en Chile, entendemos que hay solo 2) y colecta de muestra de suelos en tres zonas de la región: Pencahue, Empedrado y Molina.
• Se realizó una salida a terreno para el inicio de generación de mapa de presencia de pesticidas. Búsqueda y exploración de gases en la Región del Maule, a través de un cromatógrafo de gases portátil: Griffin G510, es un espectrómetro de masas y cromatógrafo de gases portátil que ayuda a identificar productos químicos en el campo en cuestión de minutos.

Figura 18. Griffin G510 en proceso de análisis de la muestra tomada en la Región de Maule.

Resultados

Se realizaron mediciones en las localidades de Empedrado, Molina y Pencahue.

Molina (cultivo de Maiz): Hexametilciclotrisiloxano, p-Xileno, Octametilciclotetrasiloxano, 2,2-dimetilbutano, Fenol, Etilbenceno, Octano, Tridecano, 2,2-dimetilbutano

Molina Plaza central de la ciudad: Tolueno, Etilbenceno, p-Xileno, Tridecano, Octano, 2,2-dimetilbutano, Fenol, Decametilciclopentasiloxano, n-Hexano.

Empedrado (cultivo de cerezas): Pentano, Cloruro de metileno, Ciclohexano, Acetato de etilo, Hexametildisiloxano, Acroleína, Fluoroacetamida, Octano, Nonano, σ-Xileno, Octametilciclotetrasiloxano, Mesitileno, D-Limoneno, Acetona, Fenol, Canfeno, Decametilciclopentasiloxano
Cumeno, 2,2-Dimetilbutano, Ácido 2-etilhexanoico
Dodecano, Naftalina

Empedrado (cultivo de frutillas): Tolueno, p-Xileno, Tridecano, 2,2-dimetilbutano, Octano, Fenol, Ácido dodecanoico, éster metílico.

El equipo no detectó compuestos químicos en los gases de la localidad de Pencahue.

Pentano un hidrocarburo presente en algunos combustibles, el cual se puede ver evidenciado debido que en la localidad existe una industria maderera. Cloruro de metileno o Diclorometano es un hidrocarburo presente en removedores de pintura, aerosoles e incluso en pesticidas, por tanto se puede deber a diversos factores que son indeterminables de acorde a la zona en la que se realizó el análisis. Ciclohexano utilizado para la fabricación de nailon y solvente para removedores de pintura, por tanto se puede deber a diversos factores que son indeterminables de acorde a la zona en la que se realizó el análisis. Acetato de etilo es utilizado como solvente en pinturas, por tanto se puede deber a diversos factores que son indeterminables de acorde a la zona en la que se realizó el análisis. Hexametildisiloxano es un agente tensioactivo y antiespumante, por tanto se puede deber a diversos factores que son indeterminables de acorde a la zona en la que se realizó el análisis. Acroleína se utiliza como pesticida para algas, malezas, bacterias y moluscos, además la podemos encontrar en la quema de glicerol, de esta forma, se puede ver explicado la presencia de este compuesto  debido a la quema de aceites. Fluoroacetamida es utilizada para la plaga de ratones,  por tanto se puede deber a diversos factores que son indeterminables de acorde a la zona en la que se realizó el análisis. Octano, Nonano y σ-Xileno son compuestos utilizados como combustible, parte de la gasolina, estos lo podemos encontrar por cualquier tipo de maquinaria presente en la zona de análisis que utilice como combustible hidrocarburos. Octametilciclotetrasiloxano,  lo podemos encontrar en la producción de papel y en productos que utilicen parafina, por lo que su hallazgo puede deberse al uso de maquinarias que utilizan algún tipo de parafina como medio de funcionamiento. Mesitileno, utilizado en el petróleo crudo, lo podemos encontrar en cualquier tipo de maquinaria presente en la zona de análisis que utiliza petróleo como combustible. D-Limoneno, lo podemos encontrar en fragancias, cosméticos, insecticidas y repelentes, al ser tan común no podemos saber realmente la procedencia de este compuesto. Acetona, compuesto utilizado como solvente y limpiador, por lo que es bastante común en usos como resinas, grasas, aceites, colorantes, revestimientos plásticos y barnices por lo que no podemos determinar la o las procedencia(s) de éste compuesto. Fenol, utilizado en distintas industrias como de madera, construcción, automotriz, etc. y como desinfectante, su presencia en la zona de análisis nos da entender que es usada por la industria maderera comentada previamente en el sector. Canfeno, es un compuesto que se puede hallar en la naturaleza debido a su presencia en distintos aceites esenciales, su presencia puede ser ya sea por la quema de árboles, plantas, cultivos, etc o de manera natural en el lugar situado. Decametilciclopentasiloxano, se puede encontrar en productos de limpieza, fabricación de polímeros y es usado como aditivo en combustibles, pinturas y adhesivos, al igual que los hidrocarburos mencionados, esto se puede deber al uso de maquinarias que usen combustible o a la presencia de pintura fresca del lugar cercano. Cumeno y 2,2-dimetilbutano, son componentes del combustible, al igual que los hidrocarburos mencionados su presencia puede estar correlacionada con la quema de combustible de maquinaria en el sector. Ácido 2-etilhexanoico, es utilizado como conservante de madera en industrias madereras, lo que puede explicar su aparición en la medición. Dodecano, utilizado como solvente en tintas y desengrasantes y componente de la gasolina, éste compuesto lo podemos encontrar en sitios donde es utilizado combustible como fuente de energía. Naftalina, producida a partir de la combustión incompleta, también se puede utilizar en la conservación de madera cuando se utiliza creosota, de esta forma, lo podemos encontrar en industrias madereras o procesos que involucren combustiones.

Tolueno, componente de la gasolina, aromatizantes, tintas y productos de limpieza, debido a la variedad de fuentes es incierto suponer la procedencia de éste compuesto. p-Xileno, lo podemos encontrar en la gasolina, además de estar presente como solvente de pinturas y la producción de herbicidas, debido a la variedad de fuentes es incierto saber su fuente de procedencia. Tridecano, usado en la producción de papel y textil, por tanto, falta más información de la zona para hacer supuestos de la emisión de éste compuesto. 2,2-Dimetilbutano, es un componente de la gasolina y se utiliza como solvente para pegamentos, recubrimientos y pinturas, debido a la variedad de fuentes es incierto hallar su procedencia. Octano, descrito previamente, se puede deber al uso de combustible. Fenol, descrito previamente. Ácido dodecanoico, éster metílico, es un agente aromatizante, presente como intermediario para detergentes, emulsionantes, agentes humectantes, estabilizadores, lubricantes, plastificantes, textiles, alcoholes grasos y ácidos, debido a la variedad de fuentes es incierto suponer la procedencia de éste compuesto.

Noviembre-diciembre 2023:

• Análisis in situ de distintos compuestos potencialmente tóxicos en matriz suelo-aire-agua.

Figura 4. Imágenes de los profesionales realizando distintas actividades en relación a la toma de muestras y análisis con el GC/MS Griffin G510.

Figura 6. Mapa creado en QGIS. Acercamiento a la comuna de Empedrado, podemos observar los nombres de los puntos, más los compuestos encontrados en el mes de noviembre del 2023.

 

• Segundo análisis in situ de distintos compuestos potencialmente tóxicos en matriz suelo-aire-agua.

Figura 7. Imágenes de la toma de muestra aire, agua y suelo, respectivamente.

Los resultados como mapeo territorial de los químicos detectados estarán disponibles prontamente en la página web del proyecto www.ficagroquimicos.utalca.cl

Microdispositivos basados en papel: Los aparatos de microfluidos basados en papel (paper-based microfluidic devices, PBMDs) el cual es un tipo de dispositivo microfluidico se basa en el movimiento de fluidos a través de papel. Durante los últimos 15 años se han hecho significativos avances en los PBMDs a partir del desarrollo de nuevos tipos de papeles, nuevas técnicas químicas y bioquímicas. Muchos de los resultados obtenidos a partir de estos dispositivos están basados en técnicas colorimétricas (Morbioli et al., 2017). Estas técnicas se basan en los cambios de color producidos por el contacto de un químico o compuesto biológico presente en la muestra con un indicador especialmente diseñado para este propósito. Estos PBMDs han sido desarrollados como pruebas rápidas para la detección de aditivos adulterantes (Ray et al., 2022) y bacterias patógenas en alimentos (Gao et al., 2022) en el punto de producción en terreno.

Las intensidades de color promedio en las zonas de detección del dispositivo  pueden ser determinadas usando técnicas de procesamiento de imágenes. Patari et al. (2022), usó el software libre ImageJ para obtener los valores de intensidad de color rojo (R), verde (G) y azul (B) (RGB) para un PBMDs desarrollado para detectar adulterantes en la leche. La cuantificación de los cambios de color puede ser determinada de forma experimental lo cual puede proveer datos valiosos para el desarrollo de modelos matemáticos que permitan curvas de calibración y determinación de concentraciones.

La solución planteada consiste en el diseño y desarrollo de un microdispositivo basado en papel (PBMDs), concebido para proporcionar alerta temprana sobre los niveles de exposición a plaguicidas organofosforados de manera accesible y a bajo costo en el punto de atención. La cuantificación de la exposición se realiza mediante el indicador de la “actividad de la enzima acetilcolinesterasa (AChE)”. Este enfoque se orienta a servir como una herramienta integral tanto para la salud laboral y pública como para medidas preventivas a nivel personal y comunitario. El dispositivo, diseñado como un sistema “point of care”, ha sido concebido como un PBMD, con el propósito de que pueda ser utilizado en el lugar mismo por usuarios no especializados. Esta característica permite sortear los desafíos logísticos asociados con los análisis tradicionales de este tipo de exposiciones e intoxicaciones. La propuesta de solución representa un cambio de paradigma en los sistemas de diagnóstico y prevención temprana al integrar una instrumentación de fácil uso y coste reducido.

El equipo de investigación detrás de esta iniciativa ha estado trabajando en el desarrollo de un PBMD desde el año 2019, como se detalla en el sitio web del proyecto (www.ficagroquimicos.utalca.cl). El enfoque se ha centrado en dos aspectos principales: la creación de un sistema que permita llevar a cabo pruebas y detecciones en el terreno, así como el desarrollo de una técnica bioquímica colorimétrica para la detección de la actividad de la enzima AChE. Estos esfuerzos previos proporcionan una sólida base de investigación para la implementación exitosa del microdispositivo propuesto.

El dispositivo desarrollado consiste en una tira de papel dentro de un contenedor y un aparato lector de RGB de tamaño pequeño y transportable construido con un procesador Arduino y pantalla digital, ambos impresos en con la técnica convencional de impresión 3D con filamentos. El aparato lector RGB arroja una señal sobre la zona de reacción la cual es recogida y cuantificada digitalmente con el método RGB.

Detección de la actividad de la AChE: Se desarrolló una técnica colorimétrica para la detección de la actividad de la enzima AChE mediante el cambio de color del sustrato acetilcolina-azul de bromotimol en presencia de plasma sanguíneo. Esta metodología fue elegida en vista a que la detección de intoxicaciones en nuestro país se realiza actualmente cuantificando la actividad de la AChE en plasma sanguíneo (Ministerio_de_Salud, 2016).

Pruebas con ratas en laboratorio: La metodología colorimétrica basada en papel ha sido validada para detectar la inhibición de la actividad de la AChE en ratas de laboratorio (aprobado por Comité Institucional de Ética Animal, CIECUAL, Dirección de Investigación, Universidad de Talca). En estas pruebas realizadas el año 2022 se tomaron muestras de sangre de ratas sin exposición. Luego, las mismas ratas se expusieron a diazinon (químico organofosforado), en concentraciones por sobre el límite máximo de exposición (dosis letal, 50 mg de diazinon/kg de rata). Se tomaron muestras de sangre de ratas sanas y expuestas, y se colocaron en el dispositivo. Los resultados mostraron que el indicador cambia de color desde el azul original (lado izquierdo del dispositivo) a tonalidades que van desde el verde hasta el amarillo cuando la rata está sana sin contacto con el químico.

En la Fig. 4 se observan los resultados del test colorimétrico con sangre de tres ratas cepa Sprague-Dawley de 610-662 grs. aprox. inyectadas con dosis subletal de diazinon (50 mg/kg). Post-inyección de Diazinon se esperó 60 min, tiempo necesario para obtener intoxicación la cual fue evaluada por un Médico Veterinario. El animal fue mantenido bajo anestesia suave con Ketamina para mitigar el sufrimiento animal. Los test fueron realizados con tres volúmenes distintos del indicador azul de bromotimol (12.5 uL, 25 uL y 50 uL). Los resultados del dispositivo mostrados en esta figura se obtuvieron luego de 10 minutos de reacción en la tira de papel utilizando una gota de sangre periférica extraída desde la cola de la rata. El indicador cambia de color de una forma visiblemente distinta a cuando la rata no está expuesta (ver comparación columna c) y d) de la Fig. 4). Además, la coloración cambia al variar el volumen del indicador.

Figura 4: Resultados del test colorimétrico con sangre de rata expuesta a diazinon. La sangre se extrajo luego de 60 min de expuestas al diazinon. En a) se observa el resultado del test luego de 10 min de reacción mientras que en b) se presentan los valores RGB, en c) el color promedio obtenido y en d) los colores obtenidos de la prueba con la rata sin diazinon (idem a Fig. 2). Se realizaron 3 réplicas instrumentales con la finalidad de asegurar confiabilidad de los colores observados.

Campañas en terreno con sujetos susceptibles (sangre humana): Durante noviembre y diciembre de 2023 se realizaron campañas de toma de muestras de sangre en los centros de salud familiar (CESFAM) de las comunas de San Rafael y Colbún pertenecientes a la Región del Maule (Chile) en las cuales participaron más de 80 personas. En estas campañas se siguió el protocolo aprobado por Comité Ético Científico de la Universidad de Talca (CEC, Folio: 31-2022). Las fechas de las campañas se escogieron con el fin de coincidir con la cosechas de frutos tales como las cerezas, duraznos, arándanos y ciruelas, ya que existe posibilidad de que  que en estos huertos se utilizarán algunos compuestos organofosforados. Las campañas consistieron en la toma de muestras de sangre venosa para ser enviadas al  Laboratorio de referencia (Laboratorio Clínico Loncomilla), y muestra de sangre capilar mediante técnica estéril (2 gotas del dedo) para probar in situ el microdispositivo antes descrito. También se realizó una encuesta para conocer antecedentes biométricos y de potencial exposición de los sujetos participantes. Esta encuesta tuvo como finalidad dar contexto a los resultados y conocer si el donante ha estado en contacto con compuestos organofosforados o algún medicamento que pudiera disminuir la actividad de la AChE. Se pretende con esto identificar el origen de la disminución de la actividad AChE de mostrarse en los resultados, y poder hacer los cálculos de porcentaje de actividad según edad y género. Cabe decir que algunos venenos, insecticidas y pesticidas comercializados habitualmente en el comercio tienen compuestos organofosforados. También algunos medicamentos utilizados para la enfermedad del Alzheimer contienen compuestos que disminuyen la actividad de la AChE (Khan et al., 2020).

En este punto es oportuno indicar que el plasma de la sangre de rata tiene mucho menos actividad de AChE que la de un humano por lo que la reacción colorimétrica toma más tiempo y además el cambio de color es menos evidente de los que se ha podido comprobar con plasma sanguíneo humano de personas sin exposición a químicos organofosforados. En la Fig. 3 se observan los resultados obtenidos con sangre humana de tres voluntarios sanos de 20 años, 46 años y 62 años de la comuna de Colbún (Comité Ético Científico, Universidad de Talca, Folio: 31-2022) luego de reaccionar en la tira reactiva por 10 minutos. Es posible observar un cambio de color en el papel desde el azul intenso (color inicial del indicador) hacia el amarillo de manera fiable lo que indica un porcentaje de AChE normal (comprobado a partir de los resultados de laboratorio realizados en el Laboratorio Clínico Loncomilla).

Figura 3: Resultados del test colorimétrico con sangre humana luego de 10 minutos. Voluntarios con edades de a) 20 años, b) 46 años y c) 62 años de la comuna de Colbún

Los resultados mostraron que el dispositivo es capaz de detectar cuando una persona no está intoxicada por organofosforados, sin embargo es necesario realizar investigaciones adicionales que exceden a este proyecto para calibrar las mediciones y de esta forma que mida grados de actividad de la AChE en humanos.